大规模并行测序技术和NGS平台的快速发展，使遗传性疾病的管理发生了颠覆性变化。多数基因检测早期临床研究表明，与现有方法相比，NGS可提供一种高灵敏度、高特异性以及高成本效益的诊断手段，目前，NGS在临床上越来越吸引诊断实验室。

随着基因检测的需求增加，诊断实验室面临的压力越来越大，他们需要不断提高基因突变的筛查能力，且明确变体的临床意义仍面临着巨大的挑战，同时基因检测流程的复杂性增加了NGS诊断的难度，其中包括NGS平台、富集方法以及生物信息分析的复杂性等。

高效、高性价比的突变检测方法以及标准化、系统性的NGS检测报告是诊断的基本要求。近日，Nature子刊《European Journal of Human Genetics》杂志从诊断实验室角度阐述了BRCA基因检测面临的新挑战。

挑战一：测序平台的选择

随着技术的发展，NGS平台能在较短的运行时间（<24H）内实现gigabase大规模的DNA测序，例如Illumina的Miseq和Life Technologies的PGM。

MiSeq通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。

Life Technologies公司的Ion Personal Genome Machine (PGM™) 测序仪

Ion Torrent PGM使用了一种高密度半导体小孔芯片。该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子，而离子感受器就会感受到这种信号，知道是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。

测序平台的快速发展使得一些出版物的陈述有些过时，鉴于此，诊断实验室在选择NGS平台时，应该关注平台的更新，其中包括分子生态学家等对指南的更新。

然而，平台的选择只是NGS工作流程中需要考虑的因素之一，该因素与其他因素相互依赖，包括富集方法和数据分析等。

挑战二：富集方法

与全基因组相比，NGS在临床上通常被用于检测特异性基因，如BRCA1和BRCA2基因。因为NGS捕获和检测特异性基因的成本及时间效益会更高，这也推动了多种富集方法的发展，目前最常用的富集方法依赖于PCR或杂交技术。然而，每种技术都有一定的优劣势。

PCR是一种行之有效的测序前富集技术，尤其是用于Sanger测序平台。对于NGS平台，实验室已成功开发出用于BRCA基因检测的长片断PCR技术。然而，为了充分利用NGS的高通量特性，实验人员往往会准备大量的扩增产物进行测序，这就导致了对于一个特定基因或基因Panel，市场上会发展起多个多重PCR试剂盒，例如，用于BRCA检测的多重PCR试剂盒就有Multiplicom公司的CE-IVD BRCA MASTR、赛默飞的Ion Ampliseq Community Panel 以及德国Qiagen的 GeneRead DNASeq等。虽然PCR作为高灵敏度和高特异性的富集技术，但应用在大规模基因组靶标检测时却十分低效。

杂交富集方法具有高度可扩展性等优点，目前市场上也有多种基于该技术的BRCA检测试剂盒，例如Agilent公司的HaloPlex和SureSelect，此外市场上还有包含BRCA基因在内的多种癌症基因panel检测试剂盒，例如Illumina开发了针对94个基因的试剂盒，罗氏开发了针对578个基因的试剂盒。然而，值得指出的是，当基因panel较宽泛时，杂交技术尤其是微阵列捕获技术可能会增加额外的成本以及时间。

挑战三：生物信息学分析和实验室信息管理系统

NGS检测产生的大量数据需进行生物信息学分析、变体识别（variant call）以及数据筛查后才能使用。对于NGS数据分析，诊断实验室有多种选择，然而，要获取具有临床价值的可靠数据，选择合适的分析软件和全面验证至关重要。

目前市场上的商用分析软件有 NextGENe、CLC Workbench 以及一些与具体测序平台相连的软件，例如Life Technologies的Torrent Suite Software Plugins等。一些开放的生物信息学软件可用来创建自定义生物信息学分析途径，例如， Pindel、VarScan、GATK-lite 和Samtools。然而，值得注意的是，从医学分析水平来看，从生物信息学到NGS诊断还面临很大的挑战。

追踪和管理NGS临床样本需要一个实验室信息管理系统（LIMS），该系统既支持NGS、适合诊断实验室的需求，又能灵活适应检测的变化。目前可用的商用系统数量繁多，其中一些系统主要针对NGS平台的管理，例如 Exemplar LIMS、Clarity LIMS和 Sequencing LIMS 等。然而，商用系统往往需要较高的安装成本和大量的配置才能解决实验室的具体需求。不过，目前也存在一些开放的系统如Galaxy LIMS 。

挑战四：大范围的基因组重排（LGRs）和临床意义不明的变体（VUS）

目前，深度测序法及末端配对测序法已被应用于癌症DNA的LGRs（large genomic rearrangements）检测。从NGS数据中选出LGRs受限于富集方法，PCR富集方法目前不适用于拷贝数变异（CNVs）的检测，但杂交富集方法在此方面具有一定的潜力。

然而，这类检测均需要专业的生物信息学分析，且小CNVs的检测面临着一些特定的问题，如灵敏度较低等。在NGS能常规应用于临床上的CNV综合检测之前，必须先通过大量的临床验证。

VUS是数据分析时常见的现象，目前国际上不断发起数据共享联盟，旨在推进测序方法的发展以及改进基因的变异分类。然而，值得注意的是，由于变异水平的差异，分析人员在使用公共突变数据库时应当谨慎。

总结

随着基因检测的需求增加，诊断实验室需要适应当前的检测策略及技术的发展。NGS的使用不仅可以满足不断上涨的检测需求，还能降低整体成本等。然而，NGS的选择复杂性需综合考虑多个相互依存的因素。对于检测结果的解释，尤其是解释临床意义不明确的变体时，需要进行全面且系统的评价，还需要有明确的报告，此外诊断实验室还需意识到肿瘤DNA检测面临着重大挑战。

备注：本文根据European Journal of Human Genetics网站编译，原文链接为New challenges for BRCA testing: a view from the diagnostic laboratory