作者   李召 陈志伟 任红 胡鹏  

       重庆医科大学附属第二医院感染科

丙型肝炎病毒（HCV）感染仍然是威胁人类健康的主要疾病之一。在2011年之前，其治疗方案主要是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，但是治疗效果有限，且有相当一部分人不能耐受。自2011年第一个直接抗病毒药物（DAAs）的问世以来，HCV感染的治疗开启了新的篇章。

DAAs通过阻断HCV生活周期中特异性的蛋白或酶来发挥其抗病毒作用，主要分为4类：（1）NS3/4A蛋白酶抑制剂（PIs）：作用于NS3/4A蛋白酶的活性位点；（2）NS5A抑制剂：同NS5A二聚体的1区相互作用，然而其确切的作用机制仍不清楚；（3）NS5B核苷酸类似物抑制剂：通过插入到新生RNA链并导致链终止，损害下一个进入的核苷酸的结合发挥作用；（4）NS5B非核苷酸类似物抑制剂：与NS5B拇指1，拇指2，手掌1或手掌2区结构域相互作用并通过变构作用机制抑制聚合酶活性。

DAAs用于慢性HCV感染的治疗有着较高的持续病毒学应答率（SVR），良好的耐受性和安全性。但是，值得注意的是，仍有相当数量的患者（1%～15%）不能清除病毒感染。而HCV耐药相关突变（RAVs）在这些病毒学治疗失败中起了重要作用,其对DAAs治疗结局的影响也受到广泛关注。

一、DAAs耐药相关突变的定义

HCV是一种单股正链的RNA病毒，由于HCV RNA聚合酶的低保真性，病毒基因组的错配率非常高，加上病毒复制生成的速度较快，导致HCV在患者体内形成遗传上不同却又密切相近的一群复杂HCV群体，称之为"准种" 。其中一些准种突变就发生在药物作用的靶基因上，而其中某些特定的突变就会引起DAAs的敏感性下降，称为RAVs。这也提示我们，有些RAVs在接受DAAs治疗前就已存在。此外，在接受DAAs治疗的过程中，由于药物的选择压力，也可促使病毒产生新的对抗该药物的耐药相关突变。

二、已知耐药突变及其流行率

1．NS3/4A蛋白酶抑制剂的RAVs：

目前已被批准上市的NS3/4A PIs有telaprevir，boceprevir, simeprevir，paritaprevir, grazoprevir。PIs具有相对较低的耐药屏障，导致第一代PI sboceprevir和telaprevir治疗失败的常见耐药位点有V36A/M、T54A/S、V55A、Q80R/K、R155K/T、A156S/T/V、I/V170A和D168A/E/K/T/V/Y，同时第一代PI具有广泛的交叉耐药，涉及的氨基酸位点有V36、T54、R155和A156，其中A156S/T/V被确定高水平耐药。最近研发的PIs simeprevir、paritaprevir、grazoprevir提高了其耐药的基因屏障和针对不同基因型的抗病毒活性，但R155和D168位点的氨基酸替代仍能大幅度的降低其抗病毒活性。此外，GT1a亚型患者最常见的RAVs为Q80K[相对于GT1b亚型29.5% （269/911）比0.5%（5/1096）],并且Q80K的流行具有地域性的差异：北美48.1% （185/385），欧洲19.4%（73/377），南美9.1% （2/22）。其他NS3/4A相对少见的RAVs的流行率：Q80G 0.05%，Q80L 1.9%，Q80N 0.05%，Q80R 0.6%，R155K 0.3%，D168E 0.4%，Q80K+D168E 0.05%。

2．NS5A抑制剂的RAVs：

迄今被批准上市的第一代NS5A抑制剂(daclatasvir, ledipasvir, ombitasvir)对耐药具有较低的基因屏障和广泛的交叉耐药。而第二代NS5A抑制剂elbasvir显示出较高的基因屏障。NS5A抑制剂整体显示出较广泛的基因型覆盖性。最常见的耐药相关氨基酸替代位点为：M/L28T/V、Q/L30E/H/R/S、L31M/V、H58D和Y93C/H/N。它们自然出现的频率波动在0.3%～2.8%。值得注意的是，有85%的DAAs治疗失败的患者在1～2年后HCV仍能检测出RAVs。

3．NS5B聚合酶抑制剂的RAVs：

Sofosbuvir是目前被批准上市的NS5B核苷酸类似物抑制剂，显示出极高的基因屏障，在所有单药或者与其他DAAs联合治疗的临床试验中，均没有出现病毒学突破。Sofosbuvir的耐药相关突变主要有：S282T/G/C/R，M289L，I293L，C316N，V321A，I434M，L159F/L320F，T179A。自然存在的针对sofosbuvir的RAVs至今未被发现，可能是由于S282T的变异能显著损害病毒的复制能力，这也解释了为什么在其治疗过程中没有出现病毒学突破。而当病毒出现S282S突变以及补偿性突变M343T和H479P时，可恢复病毒的复制能力。

Dasabuvir是目前被批准的唯一的NS5B非核苷类似物抑制剂，具有较低的基因屏障。总的说来，在GT1型的患者中，dasabuvir相关的预存RAVs率约0.2%～3.1%。但是，值得注意的是，在GT1b型患者中，C316N检出率却高达10%～35% 。此外，针对dasabuvir的RAVs在患者体内可存活时间较长，有文献报道，在dasabuvir结束治疗后的6个月和12个月仍有75%和57%的患者可以检测到RAVs。

三、耐药突变与临床的关系

在临床上，耐药突变对初治患者以及经治患者DAAs疗效的影响仍然是值得我们探讨的重要问题。

1．初治患者：

在DAAs初治的患者中，对NS3/4A、NS5A和NS5B抑制剂的预存耐药均有被报道。在无干扰素各种DAAs联合治疗方案的Ⅱ、Ⅲ期临床试验显示,不会显著损害病毒复制能力的中到高水平耐药的RAVs在基线占有较大比例（>15%的HCV准种）会影响以DAA为基础的联合治疗方案的病毒学结局。在simeprevir+ sofosbuvir±ribavirin治疗GT1a型肝硬化患者的临床试验中，基线存在Q80K多态性的患者其SVR率显著低于无突变者(74%比92%）。而在OCCASIONAL研究中也发现预存R155K/T/Q的多态性与GT1a型患者的治疗失败相关。最近有一篇6个临床试验的聚类分析显示，GT1b型患者接受asunaprevir+daclatasvir治疗24周，NS5A基线耐药相关变异L31F/I/M/V和Y93H的出现会分别对SVR产生影响[42%（18/43）比88%（824/936）]和[37%（38/103）比92%（804/876）]。此外，美国食品药品监督管理局（FDA）进行的一项研究显示，GT1b的患者拥有NS5B-C316N的变异与sofosbuvir联合利巴韦林的治疗失败相关。然而，也有一些临床试验并没有发现基线RAVs对DAAs治疗效果有明显的影响。

2．经治患者：

在经历过DAAs治疗失败的患者中，几乎均能发现与其治疗失败相关的DAAs耐药相关突变。在HBV和HIV的治疗过程中，相关的RAVs会在患者体内富集并持续存在，导致后续的治疗失败。而在HCV中，NS3/4耐药突变消失得最快（24～48周），其次是NS5B，最后是NS5A（数月到数年）。有文献报道，接受sofosbuvir/ledipasvir治疗的患者在8周或者12周没有获得SVR，同样的治疗方案延长至24周结果仍然不理想。而通过改变DAAs联合方案再治疗的策略在一些小型研究中却表现出较好的效果。例如，daclatasvir为基础的治疗方案失败的15例患者，在接受sofosbuvir + simeprevir的联合方案再治疗后，87% (13/15)的患者获得SVR。而经历过包含boceprevir或telaprevir的三联治疗失败的患者，接受sofosbuvir + daclatavir或者sofosbuvir + ledipasvir再治疗后，其SVR率可高达94%～100%，并且与NS3 RAVs的是否出现无关。还有研究显示，8例晚期肝硬化的患者接受各种DAAs联合方案治疗12周，均不能获得SVR，然后接受sofosbuvir + daclatasvir + simeprevir + ribavirin再治疗24周，75%的患者获得了SVR。因此，这些结果表明对于DAAs治疗失败的患者，包括那些携带RAVs的患者,更换为强效高耐药屏障的DAAs联合应当被考虑，如sofosbuvir与1～3种其他DAA的组合。建议在有不良反应因素的患者（如肝硬化患者）加入利巴韦林和（或）延长治疗持续时间至24周。密切的患者随访也是必须的，因为多药联合的安全性是未知的。如果不是紧急的需要再治疗，等待更好新药或方案是个不错的选择。

四、耐药检测的临床意义

HIV/HBV的治疗经验告诉我们，耐药的出现会严重影响其治疗结局。而在HCV中，也有不少研究发现RAVs会影响其治疗的SVR，因此临床耐药检测在初次治疗之前，治疗失败时和再次进行DAAs治疗前的意义仍有待阐明。不像HIV的临床耐药检测有标准化商品化的试剂盒，HCV的临床耐药检测方法主要有普通测序法和深度测序法，主要依靠各病毒实验室内部的技术。所以对其结果的解释也是一个挑战，因为不同实验室其普通测序的敏感性不一样。而且深度测序的截断值也没有标准化，毕竟不是所有的RAVs都有临床意义，这取决于RAVs在病毒准种中所占的比例和在相同或者不同区段的其他RAVs的出现。由于HCV耐药检测在临床广泛使用的条件仍不成熟，所以在初次治疗之前进行系统的HCV耐药检测是不被推荐的。而是可以通过一些治疗策略的优化来获得初次治疗的高SVR率。对于检测出含有能降低疗效的NS5A RAVs的肝硬化患者，指南推荐利巴韦林联合sofosbuvir/ledipasvir或者sofosbuvir + daclatasvir，或者选用sofosbuvir + simeprevir治疗12周或者延长疗程至24周以降低治疗失败率。此外，对于治疗失败的患者，在病毒学突破当时进行耐药检测不会获得有用信息，因为此时存在大量的RAVs。而对DAAs经治患者进行再治疗时，耐药检测也不是绝对必须的，但却可以指导再治疗策略的制定。

五、展望

综上所述，DAAs耐药仍是一个临床上值得关注的问题。RAVs对慢性HCV感染患者接受DAAs治疗的临床结局有一定影响，但仍待进一步大样本临床试验结果的验证。就目前而言，提高对DAAs耐药突变的重视，对规范和优化选择DAAs初治和经治方案是很有必要的。

中华肝脏病杂志, 2017,25(03): 170-174.