在寻找疾病相关基因的研究中，使用基因芯片对家系进行连锁分析，将基因定位于少数几个区域中，接着进行外显子组测序或全基因组重测序寻找候选区域中的遗传变异，是一个准确高效的研究方案。本文列举了上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科李明老师团队的两项研究，均使用了上述方法成功找到了疾病相关的基因变异位点。该研究中的Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片和外显子组测序服务由上海伯豪生物技术有限公司提供。

研究思路

研究案例

案例一 连锁分析和重测序揭示Basan综合征相关SMARCAD1突变

该研究使用了连锁分析和全基因组重测序发现了一个新的SMARCAD1基因选择性剪切突变，此突变被认为引发了Basan综合征。在此研究之前，已有研究在患有Basan综合征的美国家庭鉴定出了SMARCAD1基因的5个突变。Basan综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病，症状为可自愈的先天性肢端水疱、粟丘疹、无指纹及掌跖角化过度等。本文的研究对象是一个患有Basan综合征的家系（见图1）。具体病征见表1。

图1.1. 患有Basan综合征的家系图谱。箭头所指为先证者。

表1. 家系中8例患Basan综合征的临床表现

研究首先使用了Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片对整个家系样本进行基因分型。过滤掉低质量位点，单态位点，以及不符合孟德尔定律的位点后，得到11,152个SNPs用于连锁分析。由于Basan综合征存在类似遗传性大疱性表皮松解症的临床表现，因此先排除掉已知相关基因KRT5的突变。随后连锁分析得到了两个相关区域，为4p15.31-4p14和4q13.2-4q23。

图1.2. 全基因组连锁分析结果。最高LOD值为3.01。

接下来，研究使用了Agilent SureSelect平台对其中一例患者进行了外显子测序，测序深度为100X，但并没有发现功能相关变异。于是作者又进行了全基因组重测序，测序平台为Illumina Hiseq XTen，测序深度为平均每碱基27.94X，得到了3,832,626个变异位点（SNP和Indel）。在使用1000 Genome、HapMap 8和dbSNP135数据库过滤SNP后，在连锁分析得到的相关区域中发现两个遗传变异。第一个为c.378 +1G>T，位于SMARCAD1基因的选择性剪切位点，而另一个则为“GGC”重复，位于ANKRD17基因的第一外显子。随后，作者使用了sanger测序对这两个变异在该家系中进行了验证。结果发现，SMARCAD1基因的变异与临床表现呈共分离，但ANKRD17基因与疾病无关。

本研究的意义在于确定了该家系发病原因为SMARCAD1基因上发生的选择性剪切突变。有研究报道，该突变与无掌纹症（adermatoglphia，ADG）相关，说明ADG与Basan综合征是同一种疾病的不同表现。未来研究将解决该突变的致病机制。

案例二 全基因组连锁分析和外显子测序在Dowling-Degos病例中确定KRT5基因突变

Dowling-Degos病是一种色素性疾病，为常染色体显性遗传，特征为身体屈侧有网状色素沉着、显著的粉刺样皮疹和凹陷性瘢痕。本研究使用了患有Dowling-Degos病的家系作为研究对象，患者样本数量为19个。

图2.1. 患有Dowling-Degos病的家系图谱。箭头所指为先证者。

与上一篇研究类似，作者首先使用了Sanger测序在样本中排除了包含已知致病基因ABCB6、POFUT1和POGLUT1突变的样本，随后使用Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片进行基因分型。连锁分析将致病基因定位至12q13.12-12q14.1区域内，LOD值为3.19，定位精度为13.76 cM。

图2.2. Dowling-Degos病致病基因KRT5的定位。（a）单倍型分析；（b）连锁分析，候选区域LOD值为3.19；（c）Sanger测序验证KRT5基因变异

 随后，对其中一例患者，研究者进行了外显子组测序，平台为Agilent SureSelect，测序深度为100X。在定位区域内发现了KRT5基因起始密码子的突变c.2T>G (p.Met1?)和NEUROD4基因的一个错义突变c.376G>A (p. Ile126Val)。经过使用Sanger测序进行突变与疾病的共分离分析，后者被排除，而前者被证明与疾病相关。

总结

这两篇文章均首先使用基因芯片进行了连锁分析，将候选基因定位于具体的区段上，再使用全基因组重测序寻找该区段的遗传变异。定位到少数几个变异后，使用Sanger测序对整个家系样本进行测序，将基因型与表现型进行共分离分析，排除与疾病无关的遗传突变。这种研究方法为遗传性疾病致病基因搜寻提供了明确的研究思路。

原文出处：

Li M, Wang J, Li Z, et al. Genome-wide linkage analysis and whole-genome sequencing identify a recurrent SMARCAD1 variant in a unique Chinese family with Basan syndrome[J]. European Journal of Human genetics, 2016.

Li M, Wang J, Zhang J, et al. Genome-wide linkage and exome sequencing analyses identify an initiation codon mutation of KRT5, in a unique Chinese family with generalized Dowling–Degos disease[J]. British Journal of Dermatology, 2015, 174(3):663-666.