病例摘要
47岁女性,有吸烟史（5包/年，7年前戒烟）。主要症状为咳嗽，左侧胸痛，诊断为社区获得性肺炎。胸部和腹部的CT扫描显示LLL病变，病理性淋巴结病变（左侧纵隔，左侧肺门和右侧锁骨上）以及肝脏病变。脑MRI没有明显颅内病变。
肿瘤类型：LLL病变的CT引导下活检显示NSCLC，肺腺癌。相关标记：CK7，TTF1，MOC-31和细胞角蛋白34βE12免疫染色阳性。初始分子研究：EGFR外显子18-21的测序未显示任何EGFR突变。ALK荧光原位杂交（FISH）阳性。67％ALK重排阳性。
讨论
➤针对ALK重排的常用检测方法有哪些？
➤针对这个患者可以采用什么样的治疗方案？
ALK阳性非小细胞肺癌是指包括ALK FISH检测、或ALK序列融合变异、或ALK融合蛋白IHC特定方法检测阳性的肺癌，是非小细胞肺癌的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。
1.ALK测试有哪些可接受的方法？
肺癌中ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他基因融合。其中，EML4-ALK（棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶）融合基因变异是其主要类型，约占所有NSCLC的5%左右。
ALK可以与包括EML4，KIF5B和TFG在内的多种不同的配偶体基因进行重排，从而产生多种不同的转录物和融合蛋白。针对ALK靶点的小分子抑制剂Crizotinib（Crizotinib）是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。CAP/IASLC/AMP选择肺癌患者进行EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂分子检测指南于2013年7月发布（Lindeman，2013）。 2017年该指南将进行更新，预计将在今年晚些时候出版。更新后的指南重申并更新了2013年的大部分指南，并纳入了一些重要的新建议，包括检测所有肺腺癌患者的ROS1基因重排情况。
目前针对ALK融合基因检测常用的方法有三种——荧光原位杂交（FISH）、基于PCR扩增技术（RACE-PCR或RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等）和免疫组织化学法（IHC）。由于大量的配偶体基因和可能的重排，RT-PCR不是一种理想的筛选方法。ALK重排检测策略可能包括FISH，IHC，甚至下一代测序（NGS）。
FISH虽然是临床试验验证的标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，且不能区分ALK融合变体（fusion variants）的类型；RT-PCR对标本取材要求较高，需专用的试剂盒进行检测；IHC简便易行，但阳性标准不统一。
大部分Crizotinib治疗ALK融合阳性NSCLC的临床试验均是基于FISH的诊断，因此，FISH检测目前仍是诊断ALK融合基因的参照标准方法。FDA已批准的雅培FISH分离探针试剂盒（Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit）可用于诊断ALK融合基因的表达。该试剂盒设计的两种探针分别标记ALK基因的两端，300 kb的3’端和442 kb的5’端分别标记为橘红色和绿色。在无ALK融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；而在存在ALK融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色信号相互分离（间隔≥2个信号直径）。标本FISH阳性结果的判定标准为单个视野中的50个肺癌细胞中至少有25个存在分离信号，或者两个不同视野中的100个肺癌细胞中至少有15个存在分离信号。详细的FISH阳性判读标准可参见雅培ALK分离FISH探针试剂盒说明书。
ALK FISH技术适用的组织样本类型：10％中性福尔马林固定后石蜡包埋标本（FFPE样本），防脱玻片切片厚度3~5μm。
原位杂交技术检测ALK变异也存在不足之处。首先，FISH检测对于操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训。只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性。其次，晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活检组织，很难保证每个视野均存在50个以上的肺癌细胞进行阳性判读。FISH检测结果的判断界值（cut off）也存在商榷之处，研究发现少数ALK FISH阴性、IHC阳性的患者能从靶向药物明显获益。最后，目前FISH检测的成本昂贵，且不能明确ALK融合基因的具体融合变体。因此，虽然FISH检测仍是诊断的重要手段，但现阶段尚无法适用于中国ALK阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。
2.针对这个患者可以采用什么样的治疗方案？
2007年，肺癌患者首次检测到涉及编码ALK酪氨酸激酶基因的染色体重排（Soda，2007）。ALK重排在非小细胞肺癌中高达7％（Kris，2014）。 ALK重排的存在赋予对ALK抑制剂的敏感性（Kwak，2010）。Crizotinib是FDA批准的用于治疗ALK + NSCLC的标准方案。
与铂类化疗相比，第一代crizotinib已经在晚期ALK + NSCLC患者中显示出显着的活性，RR为74％，PFS为10.9个月（风险比为0.45）（Solomon and Mok，2015）。
第一代crizotinib是一种ALK / ROS1 / MET抑制剂，最初于2011年被美国FDA批准用于治疗晚期ALK + NSCLC。在两项随机III期试验（PROFILE 1014和PROFILE 1007）中，与一线和二线细胞毒性化疗相比，crizotinib分别使ORR，PFS和生活质量得到显着改善（Shaw，2013）（Solomon，2014）。与此例特别相关的是，在第一线crizotinib的PROFILE 1014试验中，与基于铂的化疗（Solomon和Mok，2015）相比，RR为74％，PFS为10.9个月（风险比为0.45）。基于这些研究，crizotinib成为晚期ALK阳性NSCLC的标准一线治疗药物。
虽然crizotinib已经改变了ALK + NSCLC的管理，但是2017年，还有一线ALK导向治疗的其他选择。
Ceritinib是第二代ALK TKI，具有增加的针对ALK的靶向活性（Mehra，2012）。基于ASCEND-1研究（Kim，2016）（Shaw and Engelman，2014），ceritinib最初是FDA批准用于一线crizotinib后发展为进展性疾病的患者。最近报道了ASCEND-4试验的结果（Soria，2017）。本研究将376例晚期治疗的ALK +肺癌患者随机分入ceritinib（189例）或铂 - 培美曲塞二联治疗（187例）。 Ceritinib组的中位PFS为16.6个月，而化疗组为8.1个月（HR 0.55,95％CI 0.42-0.73; P <0.0001）。使用ceritinib的中位缓解时间为23.9个月，化疗为11.1个月。值得注意的是，ceritinib的颅内反应率为57％，而化疗为22％。Ceritinib最常见的不良反应是腹泻，恶心，呕吐，疲劳和腹痛。
2017年5月，FDA扩大了对ceritinib适应证的批准，用于ALK阳性的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线治疗。
Alectinib是另一种第二代ALK TKI，其对ALK的靶向活性增加（Sakamoto，2011）。与ceritinib类似，根据两项单一研究（NP28673和NP28761）（Ou，2016）（Shaw，2016），alectinib最初是FDA批准用于一线crizotinib后发展为进展性疾病的患者。今年，在ASCO年会上，Global-ALEX研究的结果被提出，这项研究比较了alectinib和crizotinib的一线药物。本研究随机对303例晚期ALK + NSCLC患者进行alectinib或crizotinib治疗。中位PFS为alectinib为25.7个月，crizotinib为10.4个月。 12个月时，alectinib（9％）与crizotinib（41％）相比，脑转移的发生率更低。Alectinib最常见的不良反应是疲劳，便秘，肌肉疼痛和肿胀。
病例更新
该患者接受crizotinib治疗。1个月内症状好转，咳嗽减少，疼痛明显减轻。Crizotinib2周期后，CT扫描显示胸部和肝脏的肿瘤减小。占主导地位的左侧病灶尺寸从5.8×3.1厘米减小到4.6×1.7厘米。
该患者继续服用crizotinib14个月，此时间隔CT扫描显示肝脏有进行性疾病。
讨论
➤Crizotinib获得性耐药的机制是什么？
➤Crizotinib治疗后，二线治疗方案是什么？
尽管crizotinib初始反应良好,但大部分患者在治疗1年内耐药出现疾病复发,被称为获得性耐药。
1.Crizotinib获得性耐药的机制是什么？
Crizotinib耐药的机制与EGFR TKI相似，包括激酶结构域点突变，基因扩增和旁路信号通路激活。首个crizotinib获得性耐药的报道中，将一位接受crizotinib治疗复发后的腹水标本深度测序，结果提示两个不重叠的ALK酪氨酸激酶区域的突变，L1196M和C1156Y。体外实验提示以上任何一种突变都可以导致crizotinib的耐药。随后，其他ALK激酶区域的耐药突变在患者样本中陆续被发现，如G1269A、1151Tins、L1152R、1202R和1206Y。此外，ALK融合基因扩增在体内外已经被鉴定为耐药的原因。总之，大约三分之一的患者接受crizotinib治疗过程中复发是由于ALK耐药突变或ALK融合基因的扩增。第二种耐药机制为其他ALK相关信号通路的激活。体外研究提示，EGFR和`其他HER家族受体酪氨酸激酶能够通过配体介导激活ALK受体而导致耐药。此外，C-KIT基因扩增也可导致crizotinib耐药。其他潜在旁路机制包括EGFR和KRAS的激活突变等。
高达50％的第二代ALK抑制剂患者获得了ALK突变（G1202R，G1202 del，V1180L，S1206Y，E1201K等）（Gainor，2016）。值得注意的是，G1202R突变似乎是最顽固的。
肿瘤可能同时或逐步采用多种耐药机制，如何克服二线和三线的耐药是目前的挑战。
2.Crizotinib治疗后，二线治疗方案是什么？
目前已经开发了多个“第二”甚至“第三”代ALK抑制剂来尝试克服Crizotinib耐药性（表1）。这些“下一代”ALK抑制剂对ALK具有更高的靶向选择性和效力，并且与Crizotinib相比也具有更强的CNS渗透。这个领域的进展非常迅速，关于这个话题有很多信息。下面将重点总结那些已经获得监管部门批准的靶向药物。
表1 ALK抑制剂
Ceritinib是FDA批准用于治疗Crizotinib耐药或不耐受的ALK阳性NSCLC。在两项研究中评估了Crizotinib耐药患者中的Ceritinib活性。
ASCEND-1是一项单独的I期试验，其中163名ALK抑制剂预处理的患者接受了ceritinib治疗（Kim，2016）。 ORR为56％，中位PFS为6.9个月。反应的中位数（DOR）为8.3个月。 75位患有脑转移的ALK抑制剂预处理患者中，颅内疾病控制率为65％。最常见的3-4级不良事件为腹泻（6％），恶心（6％），ALT升高（30％）和AST升高（30％）。
ASCEND-2是一项II期临床试验，140名接受ALK抑制剂预处理的患者接受了每天750毫克的ceritinib（Crino，2016）。所有患者都曾接受过Crizotinib治疗。 ORR为38.6％，中位PFS为5.7个月。中位DOR为9.7个月。颅内ORR为45.0％。最常见的AES主要是1级和2级，包括：恶心（81.4％），腹泻（80.0％）和呕吐（62.9％）。
Alectinib也被FDA批准用于Crizotinib耐药或不耐受的ALK阳性非小细胞肺癌的治疗。已经在两个单臂2期研究（NP28673和NP28761）中评估了alectinib对Crizotinib耐药的患者的活性。
对于NP28761研究，87例全部接受Crizotinib治疗的患者均接受Alectinib600 mg bid。 60％的患者有基线脑转移。 ORR为48％，PFS为5.7个月（Shaw，2016）。中位DOR为13.5个月。基线时16例可测量的中枢神经系统疾病患者的颅内ORR为75％。中枢神经系统反应的中位持续时间为11.1个月。最常见的AE（大多为1级或2级）分别为便秘（36％），疲劳（33％），肌痛（24％）和外周性水肿（23％）。最常见的3-4级不良事件是CPK升高（8％），ALT升高（6％），AST升高（9％）。
对于NP28673研究，先前接受crizotinib的138名患者接受600mg bid的Alectinib。 ORR为50％，中位PFS为8.9个月（Ou，2016）。中位DOR为11.2个月。基线时35例可测量的中枢神经系统疾病患者的颅内ORR为57％。中枢神经系统反应的中位持续时间为10.3个月。最常见的AE（大多为1级或2级）为便秘（33％），疲劳（26％）和外周性水肿（25％）。最常见的3-4级AE为呼吸困难（3％），ALT升高（2％）和AST升高（％）。
小结
1.目前针对ALK融合基因检测常用的方法有三种——荧光原位杂交（FISH）、基于PCR扩增技术和免疫组织化学法（IHC）。
2.新一代测序（NGS）正迅速融入常规实验室测试。
3.ALK TKI耐药机制多种多样，包括ALK激酶结构域突变，ALK扩增，EMT和SCLC转化。
4.四种不同的ALK TKIs已经被FDA批准用于ALK + NSCLC患者。
目前仅有10年的临床前报告记录了NSCLC患者中ALK重排的情况（Soda，2007），该领域发展迅速而且显着，到目前为止我们有强有力的证据显示，未来的鉴定和治疗以ALK为目标应该是治疗的标准。四种不同的ALK TKIs已经被FDA批准用于ALK + NSCLC患者，并且患者现在正在用多种ALK TKI疗法进行常规治疗。其他的ALK TKI也正在开发中,希望更多的患者获益。
参考文献
[1]Lung Cancer (August 2017): Molecular Oncology Tumor Boards.ASCO University.
[2]张绪超, 陆舜, 张力,等. 中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊断专家共识(2013版)[J]. 中华病理学杂志, 2013, 42(6):402-406.
